一、  神經(jīng)干細(xì)胞的分離和傳代

無菌條件下取新生SD大鼠(出生48h內(nèi))腦組織，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，準(zhǔn)確分離海馬，用眼科剪將海馬剪碎后，再轉(zhuǎn)移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的無血清培養(yǎng)基，吸管吹打機(jī)械分離制作單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色后細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104~5個/ml，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入細(xì)胞懸液500μl。待神經(jīng)球形成后再次機(jī)械分離克隆制作單細(xì)胞懸液，仍以5×104個/ml的細(xì)胞濃度置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入細(xì)胞懸液500μl。此后每7d機(jī)械分離克隆傳代1次，方法同前。

二、BrdU標(biāo)記

將BrdU溶于無血清培養(yǎng)基，過濾除菌后加入神經(jīng)球形成后再次機(jī)械分離克隆制作的單細(xì)胞懸液中(BrdU終濃度為5μmol/L)，培養(yǎng)7d待新的神經(jīng)球形成后，將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，貼壁2h行BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

三、  神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

選取部分上述傳代后形成的次代神經(jīng)球種植于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，并加入有血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，另一部分神經(jīng)球繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其生長分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液后加入有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，7d后分別行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

四、  條件培養(yǎng)液的制備

取1g雞胚的后肢骨骼肌組織，加入9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min，離心獲得上清液，過濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液備用。

五、  神經(jīng)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化

將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液后分別加入條件培養(yǎng)液和有血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中對照貼壁培養(yǎng)，7d后均行ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

六、  免疫細(xì)胞化學(xué)染色

培養(yǎng)細(xì)胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分別行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫細(xì)胞化學(xué)染色，用DAB和H₂O₂作為呈色劑，陽性著色為棕黃色。具體方法為：

（1） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（2） 0.3%H₂O₂/0.05M PBS室溫 30min

（3） 0.3%Triton-100/0.05M PBS 37 ℃，15min

（4） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（5） 5%羊血清/0.05M PBS 37 ℃，15min

（6） I抗（2%羊血清/0.05M PBS配） 4℃，48h

（7） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（8） II抗（2%羊血清/0.05M PBS配，1：200） 37 ℃，1.5h

（9） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（10） AB復(fù)合物（0.05M PBS配，1：100） 37 ℃，1.5h

（11） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（12） Tris-HCl緩沖液 37 ℃，15min

（13） DAB顯色 20min

（14） 蒸餾水漂洗 10min×3次

然后，為進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞是膽堿能神經(jīng)元，將已作完ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色的細(xì)胞用PBS終止顯色以及進(jìn)一步封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后， 仍用ABC法行Tuj1免疫細(xì)胞化學(xué)染色，用含有NiCl的DAB和H2O2作為呈色劑,雙標(biāo)陽性細(xì)胞著色為藍(lán)黑色。