1.  從原代組織中分離細(xì)胞 將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，zui常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。

從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚。細(xì)胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短，以保持zui大的活性。下列步驟可以解聚整個(gè)組織，獲得較高產(chǎn)量的有活性細(xì)胞。

（1）胰蛋白酶 (Trypsin)

●在去除不需要的組織后，使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片，通過懸浮在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。

●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。

●在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

●移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

●在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

●通過無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200 mm）過濾，分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）膠原酶 (Collagenase)

●用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。

●加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。

●在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。

●通過無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

（3）Dispase

●用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

●加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液）

●在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

●通過無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

●通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

2.  從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞:以下是從基層迅速分離細(xì)胞，且保持細(xì)胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對(duì)于所有細(xì)胞系的廣泛應(yīng)用，每一種系統(tǒng)*條件和施用濃度應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)加以確定。

●再次培養(yǎng)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的活性。

●細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90%

●對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基，降低胰蛋白酶使用量。

（1） 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。

（2）使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細(xì)胞（看表確定正確的清洗溶液）。在培養(yǎng)瓶對(duì)著細(xì)胞的一面加入清洗溶液，通過轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層，然后去除清洗液。

（3） 以2～3 ml/25 cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對(duì)著細(xì)胞的一面。確保分離液覆蓋細(xì)胞層。在37℃孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。通常，在5到15分鐘內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)脫落。細(xì)胞分離需要的時(shí)間因細(xì)胞系不同而有所變化。仔細(xì)監(jiān)測(cè)細(xì)胞分離過程，避免細(xì)胞受損傷。對(duì)難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細(xì)胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。

（4）當(dāng)細(xì)胞*分離時(shí)，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基，通過移液管在單層細(xì)胞表面反復(fù)吹打來(lái)分散細(xì)胞。計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。

（5）對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。